Caractérisation des protéines

Les protéines sont composées de chaines de polypeptides complexes avec des structures uniques en 3 dimensions. Ces structures sont stabilisées par une combinaison d'interactions électrostatiques et hydrophobiques, auxquelles s'ajoute un large degré de flexibilité au sein de la structure des molécules.

Si les conditions de la solution protéinique changent, la structure de la molécule peut s'en trouver affectée, associé à un changement de la taille. Contrôler la taille d'une protéine est une façon d'observer la stabilité d'une solution de protéines dans ses conditions originelles.

Les techniques biophysiques les plus populaires de caractérisation des protéines qui sont souvent utilisées en addition à la diffusion dynamique de lumière sont :

• La spectroscopie
• La fluorescence
• Le dichroïsme circulaire
• Le scanning de calorimétrie différentielle
• La Résonance Magnétique Nucléaire
• Ultracentrifugation analytique
• Spectroscopie de rayons X aux petits angles

Dans beaucoup de cas la cristallographie des protéines par rayons X est considérée comme le nec plus ultra, étant donnée l'exactitude de la structure en 3 dimensions. Cette structure fournit des éléments de compréhension de la fonction et de la structure de chaque molécule de protéine. Cependant, la cristallisation des protéines est très consommatrice de temps avant de pouvoir déterminer une structure

La sensibilité de la diffusion de la lumière et tout particulièrement de la diffusion dynamique de la lumière, est considérée comme idéale pour effectuer un tri rapide des protéines dans différentes préparations afin de trouver les conditions optimales de cristallisation des protéines.

La diffusion dynamique de la lumière apporte une information supplémentaire à propos de votre échantillon. Cette technique non-invasive est rapide, précise et simple à réaliser, et l'échantillon peut être récupéré.

	Présentations et notes d'applications:
	Présentation à la demande sur la caractérisation des protéines utilisant la diffusion dynamique de la lumière. Cette présentation donne une vue d'ensemble des différentes applications de caractérisation des particules. Elle débute par une brève introduction sur la théorie de la diffusion statique de lumière (SLS), la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et la diffusion électrophorétique de lumière. Le mesure du point de fusion d'une protéine par la diffusion dynamique de la lumière est introduite et démontrée à travers l'exemple de l'hémoglobine. La dénaturation thermique est retardée quand la molécule est glycosylée. La forme des molécules peut être estimée quand la masse moléculaire absolue est connue. Les interactions moléculaires (par exemple les liaisons anticorps/antigènes) ou la formation d'une structure quaternaire (comme présentée sur le dimère/hexamère de l'insuline) peuvent être étudiées par la diffusion dynamique de lumière et mener à plus d'informations à propos de la solution protéinique. La diffusion de lumière statique est utilisée dans la détermination de la masse moléculaire absolue et le second coefficient de viriel. Le criblage du cristal en utilisant le second coefficient de viriel couplé à la diffusion de la lumière est une application courante. Plus récemment, le potentiel zêta a été utilisé en combinaison avec la diffusion de lumière pour évaluer un point isoélectrique et de la stabilité.
	Présentation à la demande sur les Oligomères et la structure quaternaire. La diffusion dynamique de la lumière peut être utilisée pour étudier le procédé d'agrégation. Le terme d'agrégats peut inclure les oligomères, les agglomérations et les auto-assemblages. Généralement la masse moléculaire est mesurée en utilisant la diffusion statique de la lumière. Une approche récente, plus rapide est l'estimation par la diffusion dynamique de lumière en utilisant une technique de calibration. Cette méthode, par exemple, montre une nette différence entre l'insuline sous forme de dimère à pH = 2, et une préparation dans des conditions physiologiques. L'héxamère actif a une taille significativement plus élevée que celle du dimère inactif. L'albumine du sérum bovin (BSA) est typiquement présente comme un équilibre de dimère/monomère et la diffusion dynamique de lumière est utilisée comme première évaluation du ratio de ces deux contributions.
	Note d'application sur l'utilisation de la diffusion de lumière pour la caractérisation de protéines. La stabilité d'une formulation de protéines est critique pour son succès en tant que produit pharmaceutique. Les techniques non-intrusives comme la diffusion de lumière sont idéales pour caractériser les protéines dans une variété de solutions et obtenir une de leur structure en solution. Les protéines en solution peuvent expérimenter des dénaturations thermiques, des changements dans la structure quaternaire,. Les estimations de la masse moléculaire, du second coefficient de viriel et de la forme complètent l'image de la molécule. Cette note fournit une vue d'ensemble de l'information accessible par les études de diffusion de lumière.
	Note d'application sur l'utilisation de la diffusion de la lumière pour caractériser les anticorps monoclonaux . Les anticorps sont notre défense naturelle contre les bactéries, les virus, et autres substances étrangères à diffusion hématogène. Les anticorps sont des protéines et sont enclins à s'agréger dans des conditions perturbantes de solutions. En raison de sa sensibilité aux petites quantités d'agrégats, la diffusion de lumière est idéale pour caractériser les formulations d'anticorps. Cette note d'application présente les mesures de la taille hydrodynamique, du potentiel zêta, de la masse moléculaire absolue et du second coefficient de viriel sur un fragment d'anticorps (approximativement 20 kDa).
	Note d'application sur la mesure des protéines dans une solution à faible concentration : monomère de Lysozyme à 0.1mg/ml Mesurer des molécules faiblement dispersées a été un challenge pour les systèmes de diffusion dynamique de lumière. Le lysozyme est une « protéine standard » couramment utilisée dans plusieurs tests d'évaluation de nombreuses protéines. Cette enzyme peut être trouvée par exemple dans les larmes, et est responsable de la destruction des cellules bactériennes. Le Lysozyme est relativement peu coûteux et facilement disponible. Une préparation de lysozyme d'ouf de poule dans une solution tampon d'acétate de sodium (à un pH = 4.25) est mesurée à une concentration de seulement 0.1mg/ml. La taille hydrodynamique d'un monomère est de 1.9 nm de rayon, en accord avec sa structure cristallographique. Les molécules plus grandes augmentent la diffusion de la lumière et sont détectables à des concentrations encore plus faibles.
	Note d'application sur l'utilisation de la diffusion de lumière pour évaluer l'agrégation de la β-lactoglobuline. Cette note d'application fournit une étude de l'agrégation électrostatique de la ?-lactoglobuline exposée à une faible force ionique et à un pH en dessous du point isoélectrique. Ici, l'agrégation est assez lente pour être évaluée par la diffusion dynamique de lumière (DLS). Au début de l'expérience la béta lactoglobuline est présente sous forme de dimère comme le montre la taille hydrodynamique, en cohérence avec sa masse moléculaire connue. Le temps passant, le système s'agrège et la taille moyenne se stabilise dans un équilibre entre dimères et agrégats.
	Note d'application sur les mesures des lipoprotéines en utilisant la diffusion dynamique de lumière. La taille des particules de lipoprotéines de faible densité (LDL) est un indicateur significatif de maladie cardiovasculaire. La diffusion dynamique de la lumière est une méthode rapide et facile pour déterminer la taille d'une particule dans une solution. Les mesures montrent une bonne concordance entre la diffusion de la lumière et les diamètres obtenus par l'électrophorèse des protéines sur gel.
	Note d'application sur l'étude des interactions anticorps-antigènes utilisant des techniques de diffusion de lumière. La diffusion dynamique de la lumière peut être utilisée pour étudier les anticorps dans une solution. Quand les anticorps se lient aux antigènes d'un virus, la taille moyenne hydrodynamique (moyenne Z) augmente avec le temps.
	Note d'application sur le développement de produits pharmaceutiques : Utiliser la diffusion dynamique de lumière pour examiner les inhibiteurs promiscueux. Les nouveaux composants d'avant-garde pour le développement de médicaments sont typiquement découverts en utilisant des techniques combinatoires à haut débit qui utilisent des bases de données de criblage de composés connus. Certaines de ces petites molécules ont été montrées comme ayant des ressemblances avec des médicaments. Les études montrent que leur nature inhibitrice est dépendante de la concentration et la conséquence d'une agrégation non spécifique. Cette note d'application résume les mesures réalisées sur un médicament candidat qui développe un comportement inhibiteur à certaines concentrations. L'agrégation du composé fut étudiée à l'aide de la diffusion dynamique de lumière.